引言

某一寡核苷酸原料藥產品在最后一道生產工序需經過濾來脫鹽和去除細菌內毒素，對物料進行脫鹽和去除細菌內毒素，是一道重要的工序。

考察切向流超濾技術有三個驗證指標，通過檢測溶液過濾前后細菌內毒素含量，確認超濾系統去除細菌內毒素的功能；進行超濾系統膜包的完整性檢測研究，證明其在使用后的完整性，保證膜包過濾后的完好；水通量（NWP）測試，則是為了檢驗每次系統使用后膜堆的清洗效果。

驗證部分

1.材料與儀器準備

自來水、除熱原后西林瓶、細菌內毒素檢查用水、細菌內毒素標準品、50mL量筒、1000mL量杯。

切向流超濾系統與膜包、內毒素凝膠法檢測儀、潔凈工作臺、旋渦混合器

2.實驗方法

2.1 細菌內毒素檢測

對于小核酸物料的內毒素水平控制，一方面主要依賴于廠房環境、原料、接觸物料容器具等物料的無菌和內毒素水平控制，一方面也可通過超濾的形式，以30KD或50KD截留精度膜包對小核酸物料進行超濾，實現對部分內毒素聚體的有效截留，使目標小核酸產物在透過端得到收集，實現其一定程度上對內毒素水平的有效把控。另外，對于相關緩沖液溶液的內毒素控制通？梢圓捎6-10KD的超濾膜包實現99.99%以上的截留去除效率。

采用自來水代替藥品溶液進行試驗，自來水經過超濾前后，分別用經過除熱原后西林瓶各取10瓶水進行細菌內毒素檢查（每瓶3ml）。

2.2 判斷標準

經過超濾系統過濾的自來水細菌內毒素結果應＜0.25EU/ml。

2.3實驗結果

表1  過濾前后細菌內毒素檢測結果

過濾前后細菌內毒素檢測結果顯示，供試品在過濾前，細菌內毒素部分結果不符合要求，經過過濾后，檢測結果合格，說明該超濾系統對細菌內毒素有去除作用。

2.4膜包完整性測試

檢查膜包的完整性是否符合要求，檢測方法如下：

典型測試方法之—擴散流：自檢--排空管路--計算上游體積--計算擴散流速--結束。

STEP? 01 自檢：

通過比例調節閥對管路內部施加90psi左右的氣壓，監控P1,P2,P3三處壓力的變化情況，來檢測整體管路是否有泄漏的地方。

STEP? 02 排空管路：

通過比例調節閥對管路內部施加15psi左右的氣壓，對整體管路進行排空吹掃，使管路內部無雜質污染，確保管路內部充滿潔凈的壓縮空氣。

STEP? 03 計算上游體積：

通過比例調節閥，給儲氣罐(體積v1)充入一定壓力的壓縮空氣(壓力p1)，再切換相應的電磁閥，使得儲氣罐內的氣體充滿整個上游空問(體積v2)，此時再測量出整體上游空問壓力(p2)。根據封閉空間內氣體體積置換公式 p1v1=p2v2，計算濾芯/濾膜上游空間的體積v2。

STEP? 04 計算擴散流速：

根據理想氣體方程式:m=PV/RT,通過電氣比例調節閥，給儲罐充入一定壓力的壓縮空氣，再將其壓縮空氣釋放到濾芯/濾膜上，根據單位時間內，氣體壓力的變化，計算出單位時間內，管路內氣體損失的體積，即為氣體的擴散流速。

擴散流速D=AP*V/Pt100*t

AP:測量時間內氣體的壓力衰減

V:濾芯/濾膜的上游體積

Pt100:標準大氣壓

t:測量時間

STEP? 05 結束：

打開電磁閥V5，釋放管路中的壓縮空氣。

Bio-TFF Test完整性測試儀是一款自動化的濾膜完整性檢測設備，內置壓力保持、氣泡點、擴散流速和浸入法四種檢測方式，檢測快速，操作簡單，用戶可根據濾膜種類自定義檢測條件，系統軟件可自動進行數據記錄，滿足審計追蹤功能，也支持測試結果打印。

2.5水通量（NWP）檢測

水通量測試即在受控條件下測量通過膜包的流量。將測量值轉換為標準水通量，標準水通量值指示膜包的性能好壞。通常情況下，測試的NWP不應該低于最初標準的80%。

1.使切向流超濾系統處于全回流模式，回流端和透過端均與進液容器相連。

2.在循環儲罐中加入足量的去離子水或注射用水。完全打開進液、回流和透過端閥門。

3.啟動進液泵，調節泵速和回流閥以獲得0.33bar(5 psi)的跨膜壓差。根據透出端的天平稱重和測量時間，換算出透出流速。測量并記錄進液罐中的水溫。

4.調節進液泵和回流端閥門以獲得1bar(15 psi)的跨膜壓差。根據透出端的天平稱重和測量時間，換算出透出流速。測量并記錄進液罐中的水溫。

5.排干系統。

6.計算水通量，通過以下公式把透過液流速轉化為水通量：

7.繪制計算的水通量值與跨膜壓差的關系圖

8.將計算所得的水通量值乘以不同溫度下的粘度(溫度)校正系數。例如，0.7 bar(10 psi)的水通量為115LMH，并且在透過液流速測量時水的溫度為18℃，則標準化到20°C是：115 LMHx1.053=121LMH

9.將水通量值轉化為1psi跨膜壓差下的標準值，將水通量值除以10 psi。

例如：121 LMH÷10=12.1 LMH/psi

漢凰科技的超濾系統，已內置水通量測試功能，直接調用，可自動測試膜包的水通量。

通過驗證數據表明，超濾系統測出的NWP恢復率均能達到80%以上，說明膜包反復使用過后，NWP衰減幅度不大，證明該系統平時清洗劑的選擇和清洗程序符合驗證要求，可繼續用于日常的生產。

3.濃縮和脫鹽步驟

3.1 膜包孔徑選擇

需根據小核酸分子量選擇（如5-30nt的寡核苷酸通常選用1-3 kDa截留膜），有兩種膜材聚醚砜（PES）或再生纖維素（RC）膜可選。

3.2 操作步驟

濃縮：將純化后的小核酸溶液加入超濾裝置，通過切向流循環濃縮至目標體積（如原體積的10%），避免過度濃縮導致膜堵塞，一般情況下，操作的TMP控制在1.0-1.5bar范圍內。而在超濾過程中因超濾膜孔徑精度過。詞乖赥MP相對較高的情況下，透過通量水平依然是相對較低的，這也導致超濾所需工藝時間往往很長。故此，超濾工藝過程中最佳濃縮倍數或換液時間點的確定對工藝時長影響尤為關鍵。

脫鹽：用低離子強度緩沖液（如TE或純水）置換原液，重復3-5次，直至電導率達標。

實驗室級自動切向流過濾系統

以siRNA類藥物（英克司蘭）的AS鏈濃為例，經過濃縮和脫鹽后，樣品的濃度沒有損失，回收率可達96%以上。

結論

通過對切向流超濾系統和膜包的驗證，證明了該系統可用于寡核苷酸樣品的濃縮脫鹽和內毒素去除功能，且日常采取了正確的清洗程序，能夠保證良好的清洗效果，并由此說明該技術驗證方案是合乎日常實際生產的，通過驗證，降低了日常維護成本，有利于系統的正常運行。